目前正在做一个4kb的基因片段的克隆，PCR扩增没有问题，已经切胶回收，想连接到 5.7Kb的载体上，一段为平端，一端为粘端，请问应该如何操作呢？已经做了两次与载体摩尔比3：1，转化后，PCR鉴定，无插入片段。连接时间，温度需要注重什么？ 感谢，感谢！！！！！

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1 连接温度用16度就可以，连接时间最好过夜（>12h）。
2 你可以提取质粒看看，和载体一比较就知道有没有插入片段，菌液PCR有时候不一定行。
3 外源片段、载体的量至少要有个几十ng，连接酶的量也要加大。

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eIF4A3 wrote:
1 连接温度用16度就可以，连接时间最好过夜（>12h）。
2 你可以提取质粒看看，和载体一比较就知道有没有插入片段，菌液PCR有时候不一定行。
3 外源片段、载体的量至少要有个几十ng，连接酶的量也要加大。

多谢你！
我用的这个载体，不需要连接酶连接。而是利用拓扑异构酶。
下次连接过夜试试，为什么菌液PCR不行呢，同时做的另一个基因1Kb,没问题。