各位大侠帮帮忙啊

我最近把PCR产物（260 bp）克隆到了pMD-19上，经测序序列也是正确的!但是我用双

酶切时（体系是20 ul，质粒加了2ul），目的条带非常暗（与载体亮度相差很大），根

本没法回收！我设计的引物上游带有EcoR 1酶切位点，下游带有Xho 1酶切位点，载体

上有EcoR 1酶切位点。

请教各位大侠是什么原因！是我酶切的时候质粒加少了还是其他原因！谢谢

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多切点质粒吧，260bp的条带很暗是正常的拉

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同意楼上的观点，往往切下的片断越小条带越暗。
我们做双酶切时，一般是30ul的体系切6ul的质粒，

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看看有否引入甲基化位点

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我就用这两个酶，有时候就是怀疑是否酶切完全，比如做连接的时候，切了6个小时，还是有自连的情况。我觉得你可以先测一下质粒的浓度，然后决定你的体系加多少质粒。我觉得2微升太少。

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分别用这两个酶切下

看能不能放出全长（是否切开）

假如切开了，应该没有问题。可以加大体系。我们经常用50UL体系回收

再有假如测序对了，但是切不开，一个可能的原因就是甲基化了

可以转化到不含甲基化酶的菌 中 再酶切就OK了

我们实验室有个也碰到了和你相同的问题

最后就是用不含甲基化酶的感受态菌解决的问题！

目的条带非常暗（与载体亮度相差很大）:
假如有目的条带那么一般情况下是切开了。载体的亮度大是因为载体的碱基数目多自然亮些。260bp相对于载体应该不会很亮

假如只是这两条带应该是正确的

最好把图发上来大家看下会更好！