连接液转化涂板后长了满满一平板，采用菌落PCR筛选，取4个PCR阳性的菌落提质粒，然后用PstI&BamHI 双酶切，电泳结果表明，均没有切出2kb的目的带，只在约4kb的地方有条很粗的带。
怀疑是pMD18-T载体自连，但将上述所提取的质粒分别用SalI ,XamI单酶切，电泳时用未经酶切的质粒做对照，结果单酶切和对照的带型几乎一样（最粗的一条在约8kb处）。
另外，我用提取的质粒为模板PCR ，也能扩增出目的带。
我能排除酶本身的问题，现在都不知道问题出在哪了，请问各位高手

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你有没有排除一下感受态细胞污染的问题啊，要是感受态细胞污染，已经含有一个质粒的话，你的质粒是很难再转进去了。后面的实验也很难做对了。而且连接液转化涂板后长了满满一平板，连接产物转化效率有这高，有点怀疑啊！你以前的实验连接产物转化效率也是这么高吗

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希望大家也指点一下，我昨天做的连接产物的转化和楼主出现了一样的情况，但我昨天做了空白对照，排除了感受态污染的原因。我以前还没出现连接产物转化可以长满板子的情况，希望大家给点意见。
我昨天做的三个转化，两个是将目的片段连接pMD19-T simple vector 长了20多个，还比较正常，但是目的片段连接别的PCDNA3.1却长满了.不明白是怎么回事,希望大家指点.谢谢了

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我也初步推测是感受态污染，昨天用实验室一师兄最近做的感受态重新转了一次，才涂了100ul，今早上观察平板上还是长了不下100个。现在正做菌落PCR筛选。

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关于连接产物长满平板的情况我见过，我当时用的载体是pUC18，个人觉得pUC18来源的载体很轻易转化。

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juejueok wrote:
希望大家也指点一下，我昨天做的连接产物的转化和楼主出现了一样的情况，但我昨天做了空白对照，排除了感受态污染的原因。我以前还没出现连接产物转化可以长满板子的情况，希望大家给点意见。
我昨天做的三个转化，两个是将目的片段连接pMD19-T simple vector 长了20多个，还比较正常，但是目的片段连接别的PCDNA3.1却长满了.不明白是怎么回事,希望大家指点.谢谢了

"PCDNA3.1却长满了" 是载体没有切干净吧，做个自连的对照就知道了。

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wangfeiyan wrote:
连接液转化涂板后长了满满一平板，采用菌落PCR筛选，取4个PCR阳性的菌落提质粒，然后用PstI&BamHI 双酶切，电泳结果表明，均没有切出2kb的目的带，只在约4kb的地方有条很粗的带。
怀疑是pMD18-T载体自连，但将上述所提取的质粒分别用SalI ,XamI单酶切，电泳时用未经酶切的质粒做对照，结果单酶切和对照的带型几乎一样（最粗的一条在约8kb处）。
另外，我用提取的质粒为模板PCR ，也能扩增出目的带。
我能排除酶本身的问题，现在都不知道问题出在哪了，请问各位高手

1、做个感受态的板子，看看感受态是否污染；

2、“连接液转化涂板后长了满满一平板”建议做个载体自连的对照看看载体有没有问题，假如载体自连太多了找厂家更换。

3、换不同批号pMD18-T载体再试一次。

连接的是否片段一定要定量的，不定量不计算摩尔比最不可取了。

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Novelgene wrote:
1、做个感受态的板子，看看感受态是否污染；

2、“连接液转化涂板后长了满满一平板”建议做个载体自连的对照看看载体有没有问题，假如载体自连太多了找厂家更换。

3、换不同批号pMD18-T载体再试一次。

连接的是否片段一定要定量的，不定量不计算摩尔比最不可取了。

要是载体自连的话，我用提取的质粒单酶切后电泳应该会出现载体大小的带，对吧？

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wangfeiyan wrote:
要是载体自连的话，我用提取的质粒单酶切后电泳应该会出现载体大小的带，对吧？

是的，和Marker比一下分子大小。不要和没有经过酶切的超螺旋质粒比较，后者的比较个人认为没什么意义。

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Novelgene wrote:
是的，和Marker比一下分子大小。不要和没有经过酶切的超螺旋质粒比较，后者的比较个人认为没什么意义。

可是我用XmaI&SalI分别单酶切所提取的质粒，电泳带形均和未经酶切的质粒电泳带形一样，可以看到四条带，与Maker比较，2条在10kb以上，较细，最粗的一条在约8kb处，还有一条细带在约4kb处。