连接难题！
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目的片段1.6KB 已连到T载体上 分别用 XBA1和HIND3 酶切鉴定正确
载体 5.5KB 已经测序正确 分别用 XBA1和HIND3 酶切鉴定正确
都是先用两者分别单酶切 和双酶切
将二者用 玻璃奶（GLASS MILK) 回收 ，跑胶大小正确
用PROMEGA连接酶连接，20UL体系，比例3：1或5～6：1（做了三次）
长出50～60个克隆，分两次挑了30个
挑取部分酶切 用XBAI和HIND3都没有切开的
用XBAI和HIND3两边的酶切位点也切过，APA1和BSTB1切，都没有切开！
感受态，AMP＋板，连接酶，内切酶都没有问题。
连接的时候没有设置 VECTOR的对照
另酶切的质粒都是精提的
为什么连不上呢？
过几天打算 切胶回收 换成用 过柱子的方法
请大家帮忙分析！谢谢！！
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