我提的是茶树（富含多酚和多糖）RNA
异硫氰酸胍-酸酚-氯仿抽提法
目的：用于RT-PCR,cDNA-AFLP
实验步骤如下：
1. 液氮磨样约0.14g（加了PVPP）,加异硫氰酸胍变性液1ml，2-巯基乙醇0.02ml，涡旋1min，冰浴15min，离心后把上清都倒入一新EP管内
2. 加0.1mlNaAc（PH4.0）和等体积酚：氯仿/异戊醇25：24/1两次抽提，又等体积氯仿/异戊醇一次；上清一直是淡黄色
3. 等体积异丙醇沉淀（未加盐），有肉眼可见的白色絮状沉淀（沉淀条件：-20℃2h）
4. 0.4ml异硫氰酸胍变性液溶解，加0.1mlNaAc（PH4.0）和酚：氯仿/异戊醇=0.4ml：0.1ml（未按原比例加）,离心后上清透明无色，下层呈淡黄色。
5. 等体积异丙醇再沉淀（未加盐），几乎看不到沉淀了（沉淀条件：-20℃过夜）
6. 75%乙醇洗一次，0.02mlDEPC-treated H2O溶解，立即普通琼脂糖电泳检测（结果如图从右边数1是marker，2-5泳道是检测结果）
电压：90v（稳压）
胶浓度：1%
染色液（SYBE Green I）：刚提取的RNA=0.001ml：0.005ml
电泳时间：15min
疑问：
 1）Why在第一次沉淀之前上清一直是淡黄色，怎么加酚，氯仿/异戊醇都去不掉，是多糖的原因，还是多酚氧化所致，提了两次都是这个现象？
 2）异丙醇沉淀还需要加盐来助沉淀么？假如加了对多糖的去除有帮助么？
 3）沉淀时间我的方法中是否合理，异丙醇能沉淀能过夜么？
 4）Why我的电泳图中有四条带，这四条带中有RNA么，而且点样孔怎么那么亮？
请各位前辈多多指教，小女不胜感激！

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1）Why在第一次沉淀之前上清一直是淡黄色，怎么加酚，氯仿/异戊醇都去不掉，是多糖的原因，还是多酚氧化所致，提了两次都是这个现象？
答:出现的淡黄色是褐化现象，是因为茶树中富含茶多酚所致，酚被氧化而出现淡黄色，和多糖没有关系。巯基乙醇具有抗氧化作用，在一定程度上可以降低褐化现象；此外，样品的新鲜程度也会影响褐化现象，因为有种说法是酚在植物细胞内时不会被氧化，当细胞壁破裂后，酚碰到空气中的氧气就会起褐化作用，所以假如样品不是新鲜的，很可能其中已经有很多褐化了的物质存在；还有，加快样品的研磨速度也可降低褐化。酚、氯仿在抗酚氧化中起不到作用，而且褐化一般发生在研磨过程细胞壁破裂的时候，所以对于已经出现的淡黄色物质酚、氯仿去不掉其中的颜色。
2）异丙醇沉淀还需要加盐来助沉淀么？假如加了对多糖的去除有帮助么？
异丙醇沉淀时加不加盐，其实个人觉得差别并不大，个人更偏向于不加盐。因为假如盐残余过多，会影响后续实验。
去除多糖，可加LiCl沉淀。这在园子里也有讨论过，可以搜索一下。
4）Why我的电泳图中有四条带，这四条带中有RNA么，而且点样孔怎么那么亮？
RNA电泳四条带也是可以理解的，甚至还有更多的条带。因为假如是提取植物的叶片RNA，除了常见的三条带外，还有叶绿体RNA等，所以很轻易得到多于3条带的情况。判定得到的是不是RNA，可以通过RNA的大小判定。植物28S或18SRNA的大小具有一定的大小范围。这在园子里也有讨论过，可以搜索一下。
点样孔亮，两种可能：基因组或者是蛋白

建议多看看园子里的帖子，祝实验顺利

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非常感谢hjc56的指点 ！
我用的是茶树鲜叶，材料本身应该没问题，褐化可能是巯基乙醇加少了，我只加了0.02ml，下面会改进。
才接触分子领域，我也看了很多资料和帖子的，但碰到实际问题和现象，只是怀疑还不敢很肯定，究竟经验不足，所以才请园子里的前辈们确认一下。
疑问：
1.按我的实验步骤分析，我的电泳图中有RNA么?哪两条可能是？
2.我加有机溶剂后剧烈摇摆了（想着能使溶液混匀更充分），是把gDNA晃断成两条带了么？因为同实验室的用CTAB-LiCl法做就只有两条带，从来也没出现过四条带的。
我很想知道原因， 希望大家能给我解疑！