本来不想求助的，因为这个试验实在是很麻烦，做起来麻烦，讲起来就更麻烦了，怕各位看不下去...但是时间实在是太久太久了，我不能在这么折腾下去了，所以今天小妹来发个帖求助一下，望各位大侠帮帮我，小妹在此先谢过~~~我就简单点讲了，有说的不清楚的还请大家提出来，谢谢！帮我攻克这个难关！！

我的目的片段总共有600多，其中300多bp是在英俊合成的，中间预留了三个酶切位点，依次是EcoR I、BamH I和Hind III(以下简称E、B和H），但是这三个酶切位点是紧挨着排列的，中间没有任何其余的碱基（估计这就是我后来的小片段连不进去的主要原因吧）。这三个酶切位点中要分别连入两个150bp的小片段，这样合起来构成我的目的序列。两个小片段两端的酶切位点分别是E和B、B和H。

现在合成的那些个碱基已经连进了表达载体pET32a，但是随后第一个小片段（两端是E、B酶切位点）始终连不进去。
1. 怀疑是载体没有酶切完全，然后我找了一个两端都是BamH I酶切位点的1000Bp的片段，让它先跟BamH I单酶切后的pET32a载体连接。
2. 鉴定正确连进去后，将此载体先用EcoR I酶切过夜，再直接加入BamH I酶切，虽不能保证能完全酶切，但至少肯定含有正确双酶切的载体产物，就回收了。
3. 然后再跟E、B双酶切的小片段连接。该片段是PCR后连入T载体的，而且载体本身也有我目的片段的酶切位点（！！）。转化的菌才2小时就长了？！一片，模糊，一看就不是（师姐怀疑是氨苄平板的问题）。伤心地置温箱没管它...第二天一早居然长了好几个大大的单菌落，早先那些模糊的片状菌苔反而看不太清了，挑了5个，鉴定了下都不是把我的心都伤透了！！
4. 现在重新设计了含保护性碱基的引物（用来扩两个小片段用的），预备PCR后直接酶切，然后再跟载体连。不知道这次能不能成功，要是再不行，我就，我就，我就...唉~~~真是现在把我打击的连想死的心都有了大家一定要帮帮我啊！小女子先谢过了~~~！

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这应当是一个简单的构建,没有得到预期的重组质粒,可能的主要原因有:1. 连接的片段不纯,回收片段时一定要注重避免污染没有切完全的质粒和其它无关质粒,电泳液要换新的,回收操作要非凡注间避免污染。连接前要电泳看一下回收片段的质量。2、PCR产物直接酶切做连接，尤其要注重避免作为PCR模板的质粒的污染，可以加入DpnI酶把模板质粒降解掉。3、设置对照： 至少要含有抗性基因的骨架质粒片段的自连接对照，用以了解该片段中是否混入了没有切完全的完整质粒。插入片段自连对照，了解其中是否混入了完整质粒。4、使用新的连接缓冲液。5、在酶切预备大片段时，加入CIAP碱性磷酸酶去磷，可以降低背景。6、在用EcoRI BamHI酶切你说的含有1kb插入片段的质粒时，寻找一个在这1kb内的单酶切位点，与E B一起进行三酶切，可以有效地降低背景。7、这此办法都不行的话，你就是去打听一下看谁有Invitrogen公司的GATEWAY系统，你可以将其中的CmR-ccdB片段克降进去，在配套的菌株中扩增，然后再用你的片段把它替换下来，由于有ccdB自杀基因，在DH5a中，只有重组的含有你那100多bp的片段的质粒转化菌才会长出来，这是100%能成功的方法，但我看你根本用不着这牛刀，这些东西我都有，只是人在美国，不太方便给你。
有什么问题请再回帖

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谢谢yuanrise的具体解答！第一次发帖就得到您的耐心回复，对一个新人来说真是一种莫大鼓励！我的回答如下：

1.切的时候我是有担心有没有酶切完全的混在里面，但心想肯定有酶切完全的在里面，而且不完全酶切的占少数，就回收了每次胶回收后我都跑电泳定量的，然后算pmol再行连接。
2. PCR产物直接酶切做连接，我是想这次这么干的，但没有具体的试验过程，所以还是想胶回收吧，保险一点。
3. 假如要做胶回收载体自连对照的话，10ul体系要用多少载体呢？谢谢！小片段没有做过自连对照
4. 连接缓冲液和连接酶我都用 入 Hind III做过自连试验，证实没有问题，效果挺好的。
5. 这个去磷，说真的，我倒从没做过，再考虑下试试，谢谢你的提醒！
6. 这个...估计那个1kb片段中没有
7. 最后这个牛刀我还是先保留着吧~~~呵呵！再次感谢您的指教！

下一步想试试先连接两个小片段，再用PCR方法扩增一下，酶切，再跟载体连接。有哪位大侠有这方面经验的还请您不吝赐教啊！！谢谢~~~

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不妨试试：
1.合成的那个片断（中间预留了三个酶切位点，依次是EcoR I、BamH I和Hind III），EcoR I、Hind III双酶切；
2.第一个小片段，EcoR I、BamH I双酶切；
3.第二个小片段，BamH I、Hind III双酶切；
4.胶中纯化1、2、3双酶切产物；
5.步骤4的纯化产物，即三个酶切片段放一起连接。
－－不知道有没有误解您帖子的意思。

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白马山 wrote:
不妨试试：
1.合成的那个片断（中间预留了三个酶切位点，依次是EcoR I、BamH I和Hind III），EcoR I、Hind III双酶切；
2.第一个小片段，EcoR I、BamH I双酶切；
3.第二个小片段，BamH I、Hind III双酶切；
4.胶中纯化1、2、3双酶切产物；
5.步骤4的纯化产物，即三个酶切片段放一起连接。
－－不知道有没有误解您帖子的意思。

我曾经这么做过一次，不知道是因为连接用的比例的问题还是别的什么的，反正没有连接成功。有过这方面经验的老师前辈指导一下吧！！现在是想先把两个小片段先用BamH I单酶切先连，连好了用上下游引物PCR扩增一下，再跟合成的那个片断EcoR I、Hind III双酶切的连，不知道这次会不会成功...

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