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关于NEB的T4 DNA连接酶和快速连接试剂盒的常见问题及解答
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因为看到园子中使用NEB T4 DNA连接酶的老师和同学比较多，也经常就一些连接的问题进行讨论和沟通。今天发一个关于NEB T4 DNA连接酶的一个专题，就使用过程中一些常见问题跟大家讨论一下。也希望各位老师同学能够踊跃参与，假如大家有什么疑问或者好的建议欢迎。

一、关于NEB M0202 T4 DNA 连接酶的使用方法和常见问题及解答

1、产品特性和使用方法

产品说明：该酶催化契合的双链DNA或RNA的5'-磷酸末端和3'-羟基末端形成磷酸二酯键。该酶不仅能够催化平滑末端或粘性末端DNA之间的连接，还可以修复双链DNA、RNA或DNA/RNA杂交双链中的单链切口(1)。



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来源： 源于E.coli C600 pcl857 pPLc28 lig8 (2)。

应用：

限制性酶切片段的克隆 (3)。
将linker或adapters 连接到DNA片段的平滑末端。
反应缓冲液： 1X T4 DNA Ligase Buffer:
[50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 25 µg/ml BSA, (pH 7.5 @ 25°C)]。推荐DNA浓度(0.1 - 1 µM 的5′末端)。

使用注重：ATP是反应必须的辅因子。这一点与要求NAD作辅因子的大肠杆菌DNA连接酶不同。

如在反应体系中补加1 mM的ATP，连接反应还可以在NEB提供的四种限制性内切酶缓冲液(NEBuffers)或在T4 DNA多聚核苷酸激酶缓冲液中进行。

质量保证： 无核酸内、外切酶污染。每批T4 DNA连接酶均通过模拟克隆实验进行检测，该实验可以检测出待连接DNA末端的任何破坏。结果表明>99.9%的DNA末端未受任何降解。

单位定义(粘性末端活性单位）：在20µl连接反应体系、0.12µM (300µg/ml)的5'-末端浓度条件下，16°C反应30分钟，能使50% 的经Hind Ⅲ消化的λDNA片段连接所需的酶量定义为一个NEB单位。

一个粘端连接活性单位=0.015个韦氏（ATP-PP交换）单位(4)。

一个韦氏单位=67个粘端连接活性单位。
浓度：400,000 units/ml和2,000,000 units/ml。

贮存条件： 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 200 µg/ml BSA和50%的甘油，-20°C贮存。

热失活条件: 65°C 加热10分钟。

室温连接反应：为方便起见，连接反应可以在室温（20-25°C）条件下进行。粘性末端连接：在20µl反应体系中加入1µl T4 DNA连接酶，反应10分钟。平滑末端连接：在20µl反应体系中加入1µl T4 DNA 连接酶反应2小时，或者加入1µl高浓度T4 DNA 连接酶反应10分钟。

另外，NEB的快速连接试剂盒 (Quick Ligation Kit, NEB #M2200V [15个反应])是独有的可以在室温5分钟条件下连接平滑末端和粘性末端的试剂盒。

图1：在25°C条件下，用1 unit（1:400稀释后取1 µl）T4 DNA连接酶连接λDNA/Hind Ⅲ片段(4-碱基粘端)不同反应时间的结果。 图2：在20 µl反?µ逑抵校貌煌康腡4 DNA连接酶连接平滑末端的λDNA/Hae Ⅲ片段。16°C温育30分钟。

图2：在20 µl反?µ逑抵校貌煌康腡4 DNA连接酶连接平滑末端的λDNA/Hae Ⅲ片段。16°C温育30分钟。
二、常见问题及解答

Q1：有哪些潜在原因可导致用T4 DNA连接酶连接后转化失败?
A1：
 反应体系内无ATP或Mg2 可导致连接失败：使用随酶提供的buffer或向其它兼容的buffer中加入ATP。含ATP的Buffer保存超过1年，其内ATP可能会降解，导致连接失败。当补加ATP时，确定补加的是核糖核酸ATP，而不是脱氧核糖核酸ATP，因为后者不起作用。
 反应体系中盐浓度过高或EDTA含量高都可导致连接失败：纯化DNA。
 去磷酸化步骤完成后，CIP、BAP或SAP失活不彻底：根据厂家推荐的方法去除去磷酸化酶。
 DNA浓度过高导致连接后产生的均是线性DNA：保持总DNA浓度在1-10μg/ml之间。
 连接末端为单碱基突出末端：使用最高至5μl高浓度连接酶16°C过夜连接。
 插入片段和质粒没有磷酸化。注重：假如载体已经去磷酸化了，而引物又没有磷酸化会导致连接失败，订购磷酸化的引物或对引物进行磷酸化。
 加入过多的连接混合物至感受态细胞：50μl感受态细胞应加入1-5μl连接混合物。
 插入片段太大，不能进行环化：降低插入片段的浓度，并使用高浓度连接酶16°C过夜连接。
 连接酶失活：用lambda HindIII或其它可行的底物进行检测。
 连接混合物含有PEG且连接反应过夜：长时间地在含有PEG的条件下连接可导致转化效率降低，这可能是由于逐渐产生的大片段线性DNA抑制了转化效率。快速连接试剂盒（NEB# M2200）的buffer含有PEG。
 电转化前没有提纯连接混合物：电转化必须去除buffer，否则盐会导致瞬间放电，击穿细胞。可用透析或柱纯化的方法纯化连接混合物。虽然快速连接试剂盒（NEB# M2200）buffer中含有的PEG不会导致击穿细胞，但是会抑制电转化，所以必须去除，可用柱纯化方法去除PEG。

Q2：解决转化问题时，还有什么因素需要考虑？
A2：
 感受态细胞出了问题：设置下面列出的实验对照，必要时更换新鲜感受态细胞。
 细胞不是感受态：设置下面列出的实验对照，必要时更换新鲜感受态细胞。
 大肠杆菌不能很好的接受重组蛋白：试用pMAL系统（NEB＃E8000S）表达MBP(麦芽糖结合蛋白)融合蛋白，或者试用其它不需要大肠杆菌的表达系统。
 连接的DNA片段含有反向重复的序列，不能用大肠杆菌筛选：假如可能去除重复序列，或试用其它不需要大肠杆菌的表达系统。
 插入序列来自哺乳动物、植物或者含有甲基化的胞嘧啶，会被很多大肠杆菌菌株降解：使用mcrA、mcrBC 和mrr缺失菌株。

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